Çfarë është një test PCR?
Një test PCR është një metodë laboratorike e përdorur në biologjinë molekulare dhe mjekësinë. Testi përdoret për zbulimin e drejtpërdrejtë - dhe karakterizimin - të materialit gjenetik. Metoda PCR konsiderohet nga ekspertët si e lehtë për t'u kryer, e zbatueshme universale dhe e qëndrueshme.
Në laborator, një test PCR përbëhet nga dy hapa. Në hapin e parë, materiali gjenetik ekzistues përforcohet duke përdorur reaksionin zinxhir polimerazë (PCR). Kjo lejon që të ekzaminohen gjurmët më të vogla të ADN-së. Kjo është edhe arsyeja pse testet PCR reagojnë në mënyrë kaq të ndjeshme.
Në një hap të dytë, materiali gjenetik ndahet sipas vetive të tij, “zgjidhet” dhe kështu karakterizohet. Me fjalë të tjera, përcaktohet struktura e imët e ADN-së.
Ka shumë aplikime të mundshme: mjekët përdorin një test PCR, për shembull, për të ekzaminuar tamponët për praninë e koronaviruseve, dhurimet e gjakut për HIV ose për të kontrolluar të porsalindurit për sëmundje të mundshme trashëgimore. Infeksionet bakteriale - për shembull me patogjenin e tuberkulozit - ose infeksionet parazitare (malaria) gjithashtu mund të sqarohen duke përdorur PCR.
Ato ndihmojnë gjithashtu në dënimin e autorëve në mjekësinë ligjore në bazë të gjurmëve gjenetike të gishtave të tyre ose përdoren si teste të atësisë.
Sa kohë është i vlefshëm një test PCR?
Një rezultat i testit PCR është zakonisht i vlefshëm për 48 orë nga momenti i marrjes së mostrës.
Sa i besueshëm është një test PCR?
PCR është një metodë zbulimi e provuar dhe e testuar në diagnostikimin molekular dhe mjekësinë. Konsiderohet si i ashtuquajturi standard i arit me një shkallë gabimi shumë të ulët. Testet karakterizohen veçanërisht nga një ndjeshmëri dhe specifikë shumë e lartë.
Ndjeshmëria nënkupton besueshmërinë me të cilën një test gjen materialin gjenetik që do të zbulohet.
Specifikimi nënkupton sigurinë me të cilën testi përcakton se materiali gjenetik në fjalë nuk është i pranishëm në mostër.
Kur funksionojnë testet PCR për një infeksion Sars-CoV-2?
Si rregull, testi PCR zbulon një infeksion korona dy deri në tre ditë para dhe deri në 20 ditë pas fillimit të simptomave. Edhe te njerëzit e infektuar që mbeten plotësisht pa simptoma, testi është efektiv në një periudhë kritike kohore kur ata mund të infektojnë të tjerët.
Në raste individuale, zbulimi është i mundur edhe 60 ditë pas fillimit të simptomave.
Burimet e mundshme të gabimit
Shkalla e gabimit në procesin e kopjimit të ADN-së është e papërfillshme në praktikë. Megjithëse polimerazat e ADN-së nuk janë kurrë pa gabime, ato vështirë se luajnë një rol në procedurën e testit PCR.
Në praktikë, burimet e mundshme të gabimit qëndrojnë më shumë në mbledhjen e mostrës: prandaj është e rëndësishme që profesionistët e trajnuar mjekësor të kryejnë strisone. Mostrat e pështymës dhe gargarës mund të zvogëlojnë saktësinë e testit, pasi efektet e hollimit ndodhin këtu.
Si funksionon një test PCR?
Një test PCR kryhet, për shembull, nga një mjek i familjes ose në qendra të veçanta testimi. Së pari, mjekët ose profesionistët mjekësorë të trajnuar marrin një mostër. Zakonisht merret një shtupë nga trakti i sipërm respirator për analizë. Kjo zakonisht merr formën e një shtupë goje ose nazofaringeale.
Gargara me një zgjidhje shpëlarëse është gjithashtu e mundur. Një mostër gjaku është atipike për zbulimin e koronës - por përdoret gjerësisht në shqyrtimin e të porsalindurve, për shembull.
Pavarësisht nga lloji i mostrës së marrë, materiali gjenetik gjendet në shtupë pambuku, në tretësirën e shpëlarjes ose në pikën e gjakut. Ky material mostër dërgohet në një laborator, ku izolohet dhe pastrohet.
Një test PCR ndahet më pas në dy hapa:
- PCR: Në këtë hap, sasia e materialit gjenetik fillestar përforcohet.
Hapi 1: PCR - "Reaksioni zinxhir i polimerazës"
"PCR" është i pari nga dy hapat: Këtu përforcohet sasia e ADN-së fillestare në dispozicion. Kjo është për shkak se materiali gjenetik mund të analizohet vetëm pasi të jetë i disponueshëm në sasi të mjaftueshme. Në shumicën e rasteve, kjo është ADN e njeriut; në rastin e testeve për koronavirus, është ARN virale.
Shkurtesa PCR qëndron për "reaksion zinxhir polimerazë".
Çfarë nevojitet për një PCR?
ADN-ja fillestare vendoset në një enë reaksioni me substanca të veçanta. Materiali gjenetik ekzistues shërben si shabllon, i cili kopjohet në prani të disa enzimave (Taq polimeraza) dhe disa blloqeve bazë të ndërtimit të ADN-së.
Procesi i kopjimit zhvillohet në disa ekzekutime (cikle) të përsëritura.
Në mënyrë të veçantë, substancat e mëposhtme janë shtuar së bashku:
- ADN-ja fillestare: Materiali mostër që do të kopjohet.
- Blloqet bazë të ndërtimit të ADN-së: Këto janë nukleobzat adenina, timina, citozina dhe guanina.
- ADN polimeraza: Një enzimë që lidh blloqet individuale të ndërtimit të ADN-së për të formuar një varg ADN-je të mirëpërcaktuar. Fillesa e sapo përftuar është një imazh pasqyrë (plotësues) i materialit fillestar origjinal.
- Primerë: Përbëhen nga 16 deri në 24 çifte bazash dhe shërbejnë si pozicion fillestar dhe sinjal fillestar. Primerët tregojnë polimerazën e ADN-së në të cilin pozicion (i ADN-së fillestare) fillon procesi i kopjimit.
Si kryhet një test PCR?
Tani që të gjitha substancat e nevojshme për një PCR janë të pranishme në enën e reagimit, procesi aktual i kopjimit të materialit gjenetik mund të fillojë. Kjo nis, kontrollohet dhe ndalet sërish vetëm nga temperatura.
Prandaj, ena e reaksionit nxehet ose ftohet në temperatura të ndryshme njëra pas tjetrës. Kjo bëhet duke përdorur një pajisje të veçantë të njohur si ciklues termik. I gjithë reagimi zgjat rreth një deri në dy orë.
Hapat individualë të një cikli PCR janë
- Denatyrimi i vargjeve të dyfishta të ADN-së: Mostra nxehet në rreth 90 gradë Celsius. Kjo ndan vargun origjinal të dyfishtë të ADN-së në dy fije të vetme individuale (plotësuese).
- Ngjitja e abetareve: Temperatura ulet pak nën 60 gradë Celsius. Kjo bën që primerët (primer përpara, primer i kundërt) të ngjiten në pozicione të përcaktuara në vargjet përkatëse individuale të ADN-së.
Pas një cikli të përfunduar, temperatura ngrihet përsëri në rreth 90 gradë Celsius - cikli fillon përsëri nga fillimi.
Metoda PCR mund të përdoret për të amplifikuar sekuencat e ADN-së deri në rreth tre çifte kilobase (kbp). Kjo korrespondon me rreth 3,000 blloqe bazë të ndërtimit të ADN-së të lidhura së bashku për të formuar një "zinxhir". Për krahasim: gjenomi njerëzor ruan projektet dhe informacionin për funksionimin e qelizës në rreth tre miliardë çifte bazë - gjenomi i koronavirusit, nga ana tjetër, përbëhet nga 30,000 çifte bazë. Prandaj, një test PCR mund të përforcojë dhe ekzaminojë vetëm seksione të shkurtra të ADN-së totale.
Abetaret janë vendimtare
Zgjedhja e primerëve është vendimtare për procedurën PCR. Në diagnostikimin e Sars-CoV-2, për shembull, përdoren disa primerë (Multiplex PCR).
Testet Corona PCR kërkojnë kështu për tre gjene të ndryshëm të virusit: Kjo rrit specifikën e përgjithshme në pothuajse 99.99%. Kjo do të thotë se me këtë shkallë të lartë të goditjes, ka vetëm një test fals-pozitiv për 10,000 teste (nëse mostrat merren si duhet).
Sa material gjenetik i kopjuar është tani në dispozicion?
Le të supozojmë se dy vargje të dyfishta identike të ADN-së janë të pranishme pas ciklit të parë.
Pas çdo cikli, sasia e materialit gjenetik (e kopjuar) dyfishohet. Prandaj, sasia e ADN-së rritet në mënyrë eksponenciale.
Mjekët zakonisht e përsërisin këtë proces rreth njëzet deri në tridhjetë herë.
Në mënyrë figurative, kjo do të thotë se edhe nëse në fillim gjendet vetëm një varg i dyfishtë i ADN-së në kampion, pas njëzet ciklesh ka tashmë një milion kopje identike në enën e reagimit.
Çfarë do të thotë vlera Ct?
Numri i cikleve të PCR të kryera tregohet në formën e të ashtuquajturës vlerë Ct. "Ct" rrjedh nga termi anglisht "pragu i ciklit". Kjo vlerë Ct bën të mundur që të bëhen deklarata për sasinë e materialit gjenetik që kërkohet.
Me një vlerë të ulët Ct prej 20, ka shumë material gjenetik fillestar. Megjithatë, nëse vlera e Ct është e lartë - rreth 30 cikle - ka përkatësisht pak ADN. Prandaj, cikli PCR duhet të kryhet më shpesh.
Hapi 2: Elektroforeza "Renditja sipas madhësisë"
Pasi të jetë i disponueshëm materiali gjenetik i mjaftueshëm "i pasuruar", mund të kryhet elektroforeza. Në këtë proces, shkencëtarët shfrytëzojnë një veti specifike të ADN-së: ngarkesën e saj elektrike.
Blloqet individuale të ndërtimit të ADN-së janë të lidhura me njëri-tjetrin nëpërmjet një shtylle të ngarkuar (negativisht) sheqer-fosfat. Sa më e gjatë të jetë një sekuencë e caktuar e ADN-së, aq më e lartë është ngarkesa elektrike e saj.
Kjo lejon që materiali gjenetik të ekzaminohet dhe karakterizohet. Në praktikë, një mostër e panjohur zakonisht vizatohet kundrejt një referimi të njohur në një "vijë fillestare" dhe krahasohet me njëri-tjetrin pas një periudhe të caktuar kohe.
Nëse "shpejtësia e migrimit" është e njëjtë për të dy sekuencat, kjo do të thotë se zbulimi ka shumë të ngjarë pozitiv: Zbulimi ka shumë të ngjarë pozitiv - gjeni që kërkoni gjendet në mostër.
Rast i veçantë i koronavirusit: përgatitja e mostrës dhe RT-PCR
Zbulimi i koronavirusit është një rast i veçantë. Sars-CoV-2 është një nga të ashtuquajturit viruse ARN. Kjo do të thotë se materiali gjenetik Sars-CoV-2 është i pranishëm në formën e ARN-së (acidi ribonukleik).
ARN-ja ndryshon nga ADN-ja në vetëm disa aspekte. Ndër të tjera, ai është i pranishëm si një fije e vetme dhe bazohet në ribozën e sheqerit në vend të 2'-deoksiribozës. Timina nukleobaze gjithashtu zëvendësohet nga uracili si bazë e katërt.
Kjo ARN virale duhet të "transkriptohet" në ADN përpara një testi të rregullt PCR. Ky proces quhet transkriptim i kundërt (RT) - prandaj termi RT-PCR. Një varg i vetëm i cDNA ("ADN plotësuese") merret si pjesë e këtij procesi. Në një hap të mëtejshëm, vargu i vetëm cDNA plotësohet nga një varg i dytë i ADN-së me imazh pasqyrë.
Sa kohë duhet për të marrë rezultatin?
Pasi mostra të jetë dërguar në laborator, zakonisht do të merrni një rezultat brenda një ose dy ditësh pune. Në qendrat e testimit, të cilat shpesh ekzaminojnë mostrat direkt në vend, mund të duhen gjithashtu vetëm disa orë. Hapësira kohore varet kryesisht nga qendra përkatëse e testimit dhe logjistika e saj.
Pavarësisht proceseve komplekse të punës, laboratorët modernë janë në gjendje të kryejnë teste PCR me një xhiro të lartë. Pajisjet speciale të automatizuara ndihmojnë në kryerjen e testeve.
Sidoqoftë, testi PCR konsiderohet një metodë zbulimi relativisht e "ngadaltë", por edhe më e besueshme.
Çfarë ndodh nëse rezultati është pozitiv?
Nëse kampioni merret si duhet, një test pozitiv PCR do të thotë se ka një probabilitet shumë të lartë që personi i testuar të jetë i infektuar me Sars-CoV-2.
Nëse jeni konfirmuar se jeni infektuar me koronavirus duke përdorur një test PCR, departamenti i shëndetit publik do të marrë njoftimin për rezultatin pozitiv të testit nga laboratori përkatës. Në një rast të tillë, departamenti i shëndetit publik do të urdhërojë izolim ose karantinë.
A jam automatikisht ngjitës nëse testoj pozitivisht për PCR?
Zakonisht po. Por jo gjithmonë. Një rezultat i testit PCR duhet të interpretohet gjithmonë në kontekst. Një test pozitiv do të thotë para së gjithash që ju jeni duke mbajtur material viral.
Një test shtesë i antitrupave ndonjëherë është i dobishëm
Në raste të tilla, një test antitrupash siguron siguri që konfirmon vlefshmërinë e testit PCR. Është më mirë ta diskutoni këtë me mjekun tuaj. Ato mund t'ju ndihmojnë të interpretoni saktë rezultatin e testit PCR.
Çfarë duhet të bëni nëse rezultati është negativ?
Një rezultat negativ i testit PCR ka shumë të ngjarë të thotë që ju nuk keni pasur Covid-19 në kohën kur është marrë kampioni dhe për këtë arsye nuk jeni aktualisht infektues. Megjithatë, ju mund të jeni në një fazë të hershme infeksioni.
Infeksionet korona zakonisht mund të zbulohen vetëm nga dita e dytë ose e tretë pas infektimit. Prandaj, rezultati nuk është një kalim i lirë. Prandaj, duhet të vazhdoni të respektoni rregullat e distancimit shoqëror dhe higjienës dhe të vazhdoni të mbani një maskë FFP2 - për mbrojtjen tuaj dhe të të tjerëve.
Testi PCR për fëmijët
Një test PCR për fëmijët nuk është i ndryshëm nga një test PCR për të rriturit. Si mbledhja e mostrës ashtu edhe interpretimi i rezultateve vlejnë si për fëmijët ashtu edhe për të rriturit.
Cilat janë rreziqet e një testi PCR?
Një test PCR nuk përfshin ndonjë rrezik fizik. Vetëm mbledhja e mostrës me shtupë nazofaringeale perceptohet nga disa njerëz si shqetësuese ose e pakëndshme.
Sa kushton një test PCR?
Ju lutemi vini re: Nëse e keni testuar veten në shtëpi dhe keni marrë një rezultat pozitiv, duhet të caktoni menjëherë një takim me mjekun tuaj të përgjithshëm me telefon. Mjeku juaj do të diskutojë hapat e ardhshëm me ju përmes telefonit.
Përndryshe, është mirë të telefononi 116 117 për t'u regjistruar për një test PCR. Idealisht, ju duhet të qëndroni në shtëpi deri në testin e konfirmimit për të mbrojtur veten dhe të tjerët.